0 引言 Introduction
卵巢癌是生殖性癌症中最常见的类型，也是导致妇女癌症死亡的第五大原因，2018 年卵巢癌成为全球女性发病率第七高的癌症，新增约24 万人[1-2]。顺铂和紫杉醇是治疗卵巢癌的一线药物，然而顺铂会造成严重的肝肾损害及外周神经性病变；同时由于缺乏对肿瘤组织的选择性，紫杉醇也存在着较为严重的毒副作用，因此有必要为癌症确诊患者制定新的治疗策略。
天然化合物以其高抗肿瘤活性和低毒性引起了研究人员的广泛关注。白术内酯Ⅰ(atractylenolide-I，AT-Ⅰ)是从白术中分离得到的一种天然倍半萜内酯，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理和生物学活性[4-7]。先前的研究表明，AT-Ⅰ可激活膀胱癌细胞线粒体凋亡途径，诱导细胞周期阻滞在G2/M 期并触发细胞凋亡[6]。AT-Ⅰ还通过调控ERK/GSK3β 信号通路来诱导黑色素瘤细胞的凋亡和细胞周期阻滞效应[7]。此外一项临床研究表明，AT-Ⅰ改善了胃癌恶病质患者的食欲和Karnofsky 表现状态，且观察到的不良反应较少[8]。以上这些研究表明AT-Ⅰ是一种很有前途的抗肿瘤药物，但AT-Ⅰ水溶性差、光照不稳定、渗透性低，生物利用度低，限制了其临床应用[9]。因此，为提高AT-Ⅰ的溶解度、降低口服给药的首过效应、提高生物利用率，有必要选择合适的纳米给药系统[10]。
氧化石墨烯(graphene oxide，GO)以其良好的水溶性、大的比表面积、良好的生物相容性而备受关注，其可通过π-π*堆积、静电吸引和其他分子相互作用来装载治疗药物。实验通过活化GO 表面的羧基，以聚乙二醇为中介实现精氨酸甘氨酸天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)和GO 的共价枝接，随后通过溶剂共混完成对AT-Ⅰ的负载，成功制备负载AT-Ⅰ的RGD@GO 纳米粒子(RGD@GO-AT-Ⅰ)，并对其粒径、包封率、载药量及体外口抗肿瘤作用进行评价。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 体外观察性实验。
1.2 时间及地点 实验于2018 年10 月至2019 年12 月在青海大学附属医院实验室完成。
1.3 材料 AT-Ⅰ(索宝来生物科技公司)；人卵巢癌细胞A2780(美国ATCC，Manassas，VA)；N-(3-二甲氨基丙基-N’-乙基碳化二亚胺盐酸盐)(EDC)、二吡咯烷(NSUC)、六氟磷酸碳(HSPyU)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、聚乙二醇(Sigma Aldrich)；RGD 多肽序列(北京中科亚光生物科技有限公司)；GO(南京吉仓纳米科技有限公司)；Dulbecco 改良的Eagle’s 培养基(Gibco，Inc，纽约大岛)；胎牛血清(Hyclone，Co)；碘化丙啶染色液(Sigma-Aldrich Co，美国)；原子力显微镜(VEECO Dimension icon，美国)；高效液相色谱检测仪(Ultimate 3000，Dionex，Inc.US)；FAC Scaliber 流式细胞仪(Becton-Dickinson 公司，美国)；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich)。
1.4 实验方法
1.4.1 RGD@GO 的合成 将10 mL GO 溶液(约4 g/L)水浴1 h。此后，将1.2 g NaOH 和1.0 g 氯乙酸加入到GO 溶液中继续水浴3 h。加入盐酸中和，最终产物为羧酸改性GO(GO-COOH)。将改性GO 用水稀释至约1 g/L，然后用10 g/L 聚乙二醇对其进行超声水浴5 min。然后添加浓度为5 mmol/L 的EDC 超声处理30 min，然后添加过量的EDC 搅拌12 h，添加巯基乙醇终止反应。1 h 后，在PBS 中离心得到聚乙二醇化的GO 溶液，保存上清液。随后将质量浓度为 1 g/L 的 RGD 多肽水溶液100 μL 滴加到聚乙二醇化的GO 表面，室温孵育4 h，使RGD多肽以共价方式枝接在聚乙二醇化的GO 表面，得到RGD@GO。
1.4.2 载药纳米材料的制备 将5 mL 的RGD@GO(0.05 g/L)或GO(0.05 g/L)与0.5 mL 的AT-Ⅰ DMSO 溶液(2.5 mmol/L)混合，在室温下搅拌过夜。离心，将上清液通过0.45 μm 过滤器过滤，去除固体，将保留在过滤器中的GO-AT-Ⅰ或RGD@GOAT-Ⅰ清洗4-6 次，重新悬浮在去离子水中形成的GO-AT Ⅰ或RGD@GO-AT-Ⅰ，4 ℃下贮存。
1.4.3 载药纳米材料的粒径和厚度 使用原子力显微镜对GO 和RGD@GO-AT-Ⅰ的粒径和厚度进行表征。通过将5 μL质量浓度为6 mg/L 的液体悬浮液滴在云母上，置于直径为12 mm 的金属盘上；将样品密封在经Drierite?颗粒除湿的仪器室中，并通过标准优化和一系列成像设置进行成像；样品表面用30-50 μL 去离子水冲洗2 次，去除沉积盐，温和气流干燥，检测样品，使用Nanoscope 软件(7.3 版，Bruker，CA)进行评估。
1.4.4 载药纳米材料的载药量及体外释药 AT-Ⅰ的浓度通过配备C18、4.6×250 mm 色谱柱的高效液相色谱在323 nm 处测定其含量。采用高效液相色谱法测定RGD@GO-AT-Ⅰ溶液体外释放AT-Ⅰ的浓度和载药量。将5 mL 的RGD@GO(0.05 g/L)与0.5 mL 的 AT-Ⅰ DMSO 溶液(2.5 mmol/L)混合，搅拌过夜，离心，检测上清液中AT-Ⅰ的含量，根据以下公式计算载药量：载药量(%)=(总药量-上清液药物含量)/纳米载体质量×100%。
将5 mL GO-AT-Ⅰ或RGD@GO-AT-Ⅰ溶液加入透析管(相对分子质量切断3 500)中，然后放入装有50 mL PBS (pH=7.4，含有1%十二烷基硫酸钠)的安瓶中，(37.)℃轻轻摇晃。在预先设定的时间点从安瓶取出100 μL 等份，并用100 μL新鲜介质补充，计算AT-Ⅰ总量和释放量百分比。
1.4.5 体外细胞活力分析 将人卵巢癌细胞A2780 接种到96孔板中，接种密度1×104/孔。培养24 h 后分5 组培养，分别加入PBS(对照)、RGD@GO 溶液、AT-Ⅰ溶液(20 μmol/L)、GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)、RGD@GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)各100 μL，处理24，48 h。随后，加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)再培养细胞4 h。最后取出培养基，每孔加入100 μL DMSO，酶免疫法测定570 nm处各孔的吸光度A值，计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(1-A实验组)/A对照组×100%。进行4 个平行实验，取平均值。
1.4.6 细胞周期分析 将A2780 细胞接种于6 孔板中，每孔1×106个细胞，分3组培养，分别加入PBS、GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)、RGD@GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)各250 μL，处理48 h。PBS 洗涤，体积分数70%冰冷乙醇固定，碘化丙啶染色，上FAC Scaliber 流式细胞仪检测。
1.4.7 细胞凋亡检测 将A2780 细胞接种于6 孔板中，每孔1×106个细胞，分3组培养，分别加入PBS、GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)、RGD@GO-AT-Ⅰ溶液(AT-Ⅰ浓度20 μmol/L)各250 μL，处理48 h。PBS 洗涤，Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒染色，进行流式细胞术分析。
1.5 主要观察指标 RGD@GO-AT-Ⅰ的理化性质与体外抗肿瘤活性。
1.6 统计学分析 实验数据均以表示，采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。凋亡数据和细胞活力数据采用Student’st检验进行评估，P＜ 0.05 为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 RGD@GO-AT-Ⅰ的合成与表征 GO 片的直径为(131.) nm，厚度为(1.) nm，见图1A，B，GO 片在水中具有高度的亲水性和单分散性[11-12]。为增强细胞摄取和靶向癌细胞，将聚乙二醇(3 kD)和RGD 通过共价键与GO 的羧基结合，使纳米材料的厚度增加到(11.) nm，直径减小到(56.) nm，见图1C，D。
2.2 RGD@GO-AT-Ⅰ的载药量和体外释药 RGD@GO-AT-Ⅰ的最大载药量为(28.)%。GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ中释放AT-Ⅰ的曲线见图2，最初GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ的AT-Ⅰ释放速率很快，5 h 后药物释放进入缓慢阶段，在30 h 内，GO-AT-Ⅰ的AT-Ⅰ释放率约80%，RGD@GO-AT-Ⅰ的AT-Ⅰ释放率约为70%。
2.3 体外细胞活力实验检测结果 培养24，48 h 时，与对照组比较，RGD@GO组、AT-Ⅰ组细胞存活率无明显变化(P＞ 0.05)，GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ组细胞存活率下降(P＜ 0.01)；与GO-AT-Ⅰ组比较，RGD@GO-AT-Ⅰ细胞存活率下降(P＜ 0.01)，见图3。
2.4 细胞周期分析结果 各组人卵巢癌细胞的细胞周期流式细胞仪检测结果见图4。GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ组亚G1期细胞比例高于对照组(P＜ 0.01)，G0/G1期细胞比例低于对照组(P＜ 0.01)；RGD@GO-AT-Ⅰ组亚G1期细胞比例高于GO-AT-Ⅰ组(P＜ 0.01)，G0/G1期细胞比例低于GO-AT-Ⅰ组(P＜ 0.01)，见表1。
表1 ｜各组人卵巢癌细胞细胞周期分布比例 (，%)Table 1 ｜Cell cycle distribution ratio of human ovarian cancer cells in each group表注：GO-AT-Ⅰ为氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物，RGD@GO-AT-Ⅰ为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物。与对照组比较，aP＜0.01；与GO-AT-Ⅰ组比较，bP＜ 0.01
2.5 细胞凋亡检测结果 各组人卵巢癌细胞凋亡Annexin V-FITC 染色结果见图5。相对于对照组，GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ组显示出明显的人卵巢癌细胞A2780 凋亡诱导作用(P＜ 0.01)；相对于GO-AT-Ⅰ组，RGD@GO-AT-Ⅰ组显示出更强的人卵巢癌细胞A2780 凋亡诱导作用(P＜ 0.05)，见表2。
3 讨论 Discussion
实验制备了负载白术内酯Ⅰ的靶向型氧化石墨烯纳米复合物，并对其抗肿瘤作用进行体外评价，结果显示RGD@GO-AT-Ⅰ可抑制人卵巢癌细胞增殖，降低人卵巢癌细胞G0/G1期百分率，促进其凋亡，提示RGD@GO-AT-Ⅰ有望成为治疗卵巢癌的靶向中药制剂。
图1 ｜不同纳米材料的二维表面形貌Figure 1 ｜Two dimensional surface morphology of different nanomaterials图注：A、B 为氧化石墨烯的原子力显微镜图像与粒径分布直方图；C、D 为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物的原子力显微镜图像与粒径分布直方图
图2 ｜不同载药纳米材料的体外白术内酯Ⅰ累积释放率Figure 2 ｜Cumulative release rate of atractylenolide-I from different drugloaded nanomaterialsin vitro图注：前5 h，氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物(GO-AT-Ⅰ)、负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物(RGD@GO-AT-Ⅰ)的白术内酯Ⅰ释放速率较快，5 h 后药物释放进入缓慢阶段；30 h 内，RGD@GO-AT-Ⅰ的白术内酯Ⅰ释放率约为70%，GO-AT-Ⅰ的白术内酯Ⅰ释放率约80%
图3 ｜培养不同时间点各组人卵巢癌细胞存活率Figure 3 ｜Survival rate of human ovarian cancer cells in each group at different time points图注：RGD@GO 为精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物，AT-Ⅰ为白术内酯Ⅰ，GO-AT-Ⅰ为氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物，RGD@GOAT-Ⅰ为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物。与对照组比较，aP＜ 0.01；与GO-AT-Ⅰ组比较，bP＜ 0.01
图4 ｜各组人卵巢癌细胞细胞周期流式细胞术检测结果Figure 4 ｜Flow cytometry results of cycle of human ovarian cancer cells in each group图注：从左至右依次为对照组、GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ。GOAT-Ⅰ为氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物，RGD@GO-AT-Ⅰ为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物
图5 ｜各组人卵巢癌细胞凋亡Annexin V-FITC 染色结果Figure 5 ｜Annexin V-FITC staining results of human ovarian cancer cell apoptosis in each group图注：从左至右依次为对照组、GO-AT-Ⅰ组、RGD@GO-AT-Ⅰ。GOAT-Ⅰ为氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物，RGD@GO-AT-Ⅰ为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物
表2 ｜各组人卵巢癌细胞早期与晚期凋亡比例 (，%)Table 2 ｜Proportion of early and late apoptosis of human ovarian cancer cells in each group表注：GO-AT-Ⅰ为氧化石墨烯-白术内酯Ⅰ复合物，RGD@GO-AT-Ⅰ为负载白术内酯Ⅰ的精氨酸甘氨酸天冬氨酸-氧化石墨烯复合物。与对照组比较，aP＜0.01；与GO-AT-Ⅰ组比较，bP＜ 0.01
用氯乙酸将GO 片上的羟基转化为羧基，可使其颜色由浅棕色转变为深棕色[13]，故使用原子力显微镜对GO 和RGD@GO-AT-Ⅰ的形貌进行评价，结果显示相对于GO，RGD@GOAT-Ⅰ的粒径降低、厚度增加。众所周知，GO 片较为坚韧，几乎不能破碎成更小的尺寸，而功能化GO 在轻微超声作用下可破碎成较小的尺寸(＜ 100 nm)，这将有利于细胞渗透[14-15]。有研究表明，尺寸大于100 nm的GO不能很好地内化到细胞中去，而横向尺寸小于100 nm 的GO 可顺利穿过细胞膜。此外，功能化的GO 使材料厚度增加，同时改变GO 的表面和锐利边缘，使其成为具有不同形态和性质的三维结构，锐利边缘可切割细胞膜，而修饰后可降低GO 对正常细胞的毒性[15]。
MTT 检测结果表明，AT-Ⅰ在20 μmol/L 时对人卵巢癌细胞A2780 无明显毒性，而GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ的毒性作用显著，这可能是由于GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ中AT-Ⅰ的缓释效应在一定时间内维持细胞内药物浓度，有利于抑制A2780 细胞的增殖；其次，RGD@GO-AT-Ⅰ可促进细胞摄取更多的AT-Ⅰ，从而显示出比其他AT-Ⅰ制剂更高的细胞活力抑制作用。一般而言由于二维结构，GO 未修饰的锋利边缘可造成细胞损伤，修饰后GO 的细胞毒性作用可能下降[15]。此次实验结果显示，RGD@GO-AT-Ⅰ的细胞毒性显著提高，这说明RGD 的靶向修饰可能在代偿GO 物理损伤降低的基础上提高AT-Ⅰ对A2780 细胞的毒性，这进一步说明了靶向作用的有效性。
实验结果显示，GO-AT-Ⅰ、RGD@GO-AT-Ⅰ均可诱导人卵巢癌细胞A2780 凋亡，并且相对于GO-AT-Ⅰ，具有靶向作用的RGD@GO-AT-Ⅰ显示出更强的凋亡诱导作用(P＜ 0.01)。细胞凋亡在维持正常组织内稳态方面发挥着关键作用[16]。设计和开发能够诱导癌细胞凋亡的药物是治疗癌症有效的途径。石墨烯和石墨烯基纳米复合材料(如石墨烯/银纳米复合材料)的潜在生物医学应用已被开发用于多种疾病[17-19]，然而石墨烯基无机纳米复合材料的抗癌性能很少被测试，因此实验评估新合成纳米复合物GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ的抗癌活性和诱导细胞凋亡的能力。
一些抗癌化合物通过细胞周期阻滞和/或凋亡诱导来实现对癌细胞生长的抑制作用[20]。此次体外凋亡实验结果表明，RGD@GO-AT-Ⅰ对人卵巢癌细胞A2780 有明显的抑制作用，并且相对于GO-AT-Ⅰ，RGD@GO-AT-Ⅰ对人卵巢癌A2780 细胞的抑制作用更强。GO-AT-Ⅰ和RGD@GO-AT-Ⅰ具有相似的AT-Ⅰ释放曲线，且RGD@GO 材料未显示出明显的细胞毒性，故RGD@GO-AT-Ⅰ诱导凋亡作用的提高可以归因于RGD 的靶向。
开发能诱导细胞凋亡的抗癌药物是肿瘤治疗一个很有潜力的方向。实验制备负载AT-Ⅰ的靶向GO 纳米复合材料，并研究其体外抗癌性能，结果显示：RGD@GO-AT-Ⅰ具有较低的横向直径、较高的载药量及良好的药物释放曲线，可降低人卵巢癌细胞A2780 G0/G1期细胞百分率，增加人卵巢癌细胞A2780 亚G1期百分率，诱导人卵巢癌细胞A2780 凋亡。石墨烯基的靶向中药载体将拓宽植物提取物的应用范围，为靶向型中药制剂的研发提供一条新思路。
作者贡献：实验的设计、实施及成文均为甘芳。
经费支持：该文章接受了“青海省卫计委一般指导性课题(2018wjzdx-101)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
生物统计学声明：该文统计学方法已经青海大学生物统计学专家审核。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
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文章来源：肿瘤影像学 网址: http://zlyxx.400nongye.com/lunwen/itemid-62641.shtml
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